PCR儀校準是實驗中一定要去做的事情，一個穩(wěn)定的溫度循環(huán)是成功實現(xiàn)PCR所必需的。其中溫度控制的動、穩(wěn)態(tài)特性是影響PCR擴增結(jié)果正確與否的重要因素之一, 這包括溫度準確性、升降溫速度、溫場均勻性、大超調(diào)溫度。

　　PCR就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內(nèi)In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進行專一性的連鎖復(fù)制。目前常用的技術(shù)，可以將一段基因復(fù)制為原來的一百億至一千億倍。根據(jù)DNA擴增的目的和檢測的標準，可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實時熒光定量PCR儀四類。

　　PCR儀校準的項目有以下幾點：

　　一、溫度準確性

　　溫度準確性是PCR儀重要的性能指標，如溫度準確性低可直接造成非特異性擴增，甚至是錯誤的擴增結(jié)果，造成假陽性和假陰性。

　　市場上各家廠商考核基因擴增儀PCR儀性能的主要指標，一般廠家的企業(yè)指標為±0.5℃，一些性能較好的產(chǎn)品可以實現(xiàn)的溫度準確度為±0.3℃。故需對PCR儀控溫準確度進行測試。校準實驗平均溫度的計算公式為：I—參加檢測的溫度探頭序號；n—參加檢測的溫度探頭的數(shù)量

　　二、溫場均勻性

　　由于PCR儀加熱器加熱不均勻，導(dǎo)致PCR儀模塊上各孔存在一定溫差。造成試驗結(jié)果偏差。一般PCR儀邊緣點的溫度低于中間區(qū)域，所以均勻性為PCR儀重要的性能指標。一般廠家的企業(yè)指標規(guī)定均勻性為±0.5℃，一些性能較好的產(chǎn)品可以實現(xiàn)的溫度均勻度為±0.3℃。

　　校準實驗時，通過選取孔板中16個特殊反應(yīng)位置來測量溫度，并得出孔板的溫度均勻性。均勻性為各個探頭在同一時刻大溫度與小溫度的差值。均勻度計算公式為：tmax-tmin  tmax =大溫度；tmin =小溫度

　　三、升降溫速率

　　PCR儀校準中擴增產(chǎn)物數(shù)量的多少決定了PCR的效率。為了在短時間內(nèi)獲得盡可能多的產(chǎn)物，需要儀器在升降溫段具有按照預(yù)設(shè)升降溫速率快速升溫和降溫的能力大升溫速率達15~20℃。一個完整的PCR過程，是由若干個升溫→恒溫→降溫循環(huán)構(gòu)成的。因為“變性”，“退火”和“延伸”3個階段是必須要保證的。

　　因此，只有使升降溫的過程盡可能地迅速，才能縮短每個PCR循環(huán)以及整個PCR 過程所需時間。一般廠家的企業(yè)指標規(guī)定升溫速率為±3℃/sec。儀器校準實驗時，升溫速率為溫度從40℃到90℃的時間；降溫速率為溫度從70℃到35℃的時間。

　　四、大超調(diào)溫度

　　當溫度從一定點溫度調(diào)節(jié)到另一定點溫度,就會產(chǎn)生溫度的超調(diào)。超調(diào)溫度過大同樣會對試驗產(chǎn)生影響，所以校準實驗時，需要計算大超調(diào)溫度和平均超調(diào)溫度。